近日，重庆医科大学附属儿童医院抗原识别数字免疫与基因编辑平台殷雷团队在国际知名学术期刊Nature Communications上发表题为“Highly parallel profiling of the activities and specificities of Cas12a variants in human cells”的研究论文。

这项研究首次系统评估了24种Cas12a变体的基因编辑活性、PAM兼容性及脱靶效应，并开发了深度学习模型预测编辑效率，同时优化了GUIDE-seq方法（命名为enGUIDE-seq）。

这一成果为CRISPR-Cas12a的临床转化提供了重要工具和理论支持。这些创新点不仅推动了基因编辑技术的进一步发展，也为未来精准医疗和生物技术应用奠定了坚实的基础。

近年来，基因编辑技术CRISPR-Cas12a的应用范围不断扩大，其在疾病治疗、农业改良等领域的潜力备受关注。然而，随着Cas12a变体的不断增多，如何选择合适的变体以实现精准的基因编辑，成为了研究人员面临的一大挑战。

此外，尽管Cas12a在基因编辑中的效率和特异性有所提升，但针对不同靶序列的编辑预测仍缺乏系统性的评估工具和技术。这些问题不仅限制了基因编辑技术的广泛应用，也增加了实验中的不确定性和风险。

研究团队高通量分析了24种Cas12a变体的工程化结构域、突变位点及PAM识别范围。然后，合成4个寡核苷酸库（As、Lb、Ce/Eb/Fn、Lb2），覆盖15种PAM及11968个靶序列。将靶序列文库通过慢病毒（MOI=0.4）整合至HEK293T基因组，嘌呤霉素筛选后获得单拷贝整合细胞库，进行深度测序与数据分析。

通过热图展示了各变体在15种已知PAM上的平均编辑效率，并进一步比较了不同变体对TTTA、TTTC、TTTG的编辑差异，发现大多数变体在TTTG位点活性更高，可能与局部染色质开放状态相关。

研究团队检测了PAM 5' 端核苷酸对Cas12a切割靶序列的影响。实验结果表明，PAM上下游序列的碱基组成是影响Cas12a活性的关键因素。

同时，研究团队开发了用于预测Cas12a变体活性的计算模型，对比了各模型之间的预测精度，结果表明与现有模型（DeepGuide、CRISPR-DT）相比，enDeepCpf1在内外源靶点的预测中均表现最优。

研究团队发现：在传统GUIDE-seq中，Cas12a切割dsODN标签产生18-34 nt片段，导致引物无法结合。而enGUIDE-seq通过优化引物设计（Tag-F5/R5和Tag-F7/R7）显著提升标签捕获效率。进一步，enGUIDE-seq解决Cas12a脱靶检测瓶颈，首次报道了Cas12a变体的染色体易位频率（0.1%-2%）。